DNA提取试剂盒的操作方法

全套操作约需1小时，分匀浆、细胞裂解、除蛋白、DNA纯化等步骤，详细说明如下。匀浆和细胞裂解:使用不同的实验材料需采用不同的匀浆步骤，具体说明如下：【从动物组织中提取基因组DNA】使用研钵进行匀浆时：①取1～100mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中，快速用力展研成匀浆。注）下列组织请加液氮研磨至粉末状。A．富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等组织。B．富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。C．富含角质蛋白的组织或坚硬的组织（如骨骼）等。②加入650μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1，温和研磨30秒钟。注）使用上述①-注）的实验材料时，请在加入SolutionA及RNaseA1后，将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟。③收集650μl研磨好的组织匀浆液移至CollectionTube中。如果匀浆体积不足650μl，请补充SolutionA至650μl，65℃保温5分钟。使用研磨棒进行匀浆时:①取1～100mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的CollectionTube中，用研磨棒快速研磨成糊状。②加入350μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1后用研磨棒快速研磨成匀浆。③加入350μl的SolutionA将研磨棒上的匀浆冲入CollectionTube中，充分振荡混合后，65℃保温5分钟。【从植物材料或植物培养细胞中提取基因组DNA】①按下表称取适量的新鲜植物材料（如选用的是冷冻干燥植物材料，则用量减半），剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。植物材料种类植物材料使用量*植物花、叶片10～100mg植物茎60～240mg植物根80～240mg植物种子80～240mg*如选取植物的根、种子等样品时，因其基因组DNA含量很低，需使用超过表格中所示的参数用量，此时请分两管进行步骤1～6的实验操作，在步骤7的操作中再将各管溶液分次加入至同一SpinColumn中过滤，使各管的基因组DNA结合到同一个SpinColumn上。如从培养的植物细胞中提取基因组DNA，请离心收集2×103～1×107的培养植物细胞，加入150μl水充分悬浮细胞后移入研钵中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末状。注）样品研磨应充分，否则将会严重影响基因组DNA的收率。②将研钵移至65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加入700μl的SolutionA和1.2μl的RNaseA1，用力碾磨30秒。③收集650μl研磨好的组织匀浆移至CollectionTube中。如匀浆体积不足650μl，请补充SolutionA至650μl。65℃保温15分钟。注）处理富含纤维的根/茎等植物材料或富含淀粉、蛋白质的种子等时，可延长水浴时间至60分钟。【从全血中提取基因组DNA】①取10～250μl的全血（含抗凝剂）加入至CollectionTube中。②加入500μl的SolutionA。③加入1μl的RNaseA1，激烈振荡15秒钟后，冰浴5分钟。注）人与动物的抗凝全血的一次处理量为≤250μl；禽类、两栖类的抗凝全血的一次处理量为≤10μl。【从培养细胞中提取基因组DNA】三.使用悬浮培养的动物细胞时：①使用CollectionTube收集1×105～1.5×107的细胞悬浮液，5,000rpm离心5分钟，弃上清（细胞培养液）。②加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。③加入500μl的SolutionA和0.8μl的RNaseA1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。四.使用贴壁细胞时：①弃尽培养液，向培养皿中加入650μl的SolutionA，室温静置1分钟。注）96孔板等的每个孔中一次容纳不了650μl溶液时，请分数次处理细胞。②用移液枪的枪头吹落贴壁培养细胞，取650μl的细胞悬浮液转移至CollectionTube中。③加入0.8μl的RNaseA1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。2.加入400μl的SolutionB，振荡混合。3.加入1ml的4℃预冷的SolutionC，充分混匀后，12,000rpm离心2分钟。4.弃去上层有机相，再加入1ml的4℃预冷的SolutionC，充分混匀后，12,000rpm离心2分钟。5.弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于CollectionTube上的FilterCup中，12,000rpm离心1分钟。注）有机相（上层）带有颜色，请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。相间沉淀不必考虑，在过滤时将被去除。6.弃FilterCup，在滤液中加入400μl的DBBuffer，混合均匀。7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。将上述操作6混合溶液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。8.将500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。9.将700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。注）请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。10.重复操作步骤9。11.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。12.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。如果实验室备有适合于SpinColumn接口的负压装置，可从上述操作步骤6完成以后进行以下操作。7.将试剂盒中的SpinColumn插到负压装置的插口上，将上述操作步骤6的混合溶液转移到SpinColumn中，开启调节负压装置，缓慢吸走SpinColumn中的溶液（流速控制在1滴/秒）。8.将负压调至最大，向SpinColumn中加入500μl的RinseA，吸尽SpinColumn中溶液。9.向SpinColumn中加入700μl的RinseB，吸尽SpinColumn中溶液。注）请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。10.重复操作步骤9。然后从负压装置上取下SpinColumn，将其安置于试剂盒中的CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。11.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。12.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。